hoechstPI染色VIP专享

2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342 均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI 不能通过正常的细胞膜，Hoechst 则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI 着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst 着色，但是正常细胞核的Hoechst 着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI 着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst 着色的为调亡细胞。电子天平准确称取1mg 碘化丙啶（propidiu m iodide，PI）溶于10ml PBS（PH 7.2），成100u g/ml的储备液，用前等量混合（注意避光） protocol: 1、收集细胞，数量需1－2×10E6 个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。 2、 用1ml 冰冷的PBS 重悬后，离心：11,000rpm，5min。 3、用200μl 冰冷的PBS 重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml 冰冷的70％乙醇的10ml 离心管中，边加边摇匀。－20℃，过夜。（或者置 4℃，1h 后进行下一步） 4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml 冰冷的PBS 重悬，1,500rpm，5min。小心弃上清。 5、 加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml 的RNase 的PBS 溶液500μl，37℃，培养 30min－1h。 混匀。 溶液配方：PBS 910μl PI 80μl RNase 10μl 共 1ml 6、过滤，供流式检测。 Hoechst 33342/PI 双染色法 紫外光激发, Hoechst-PI 双染在荧光显微镜下可见 4 种细胞形态: 活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构; 早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状; 晚期凋亡细胞(NVA) ,也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。 非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红色,核呈正常结构; 贴壁细胞： 1、培养细胞中加入hoechst染液，终浓度5μg/ml； 2、37℃，避光染色10min， 3、继续加入的PI 染液，终浓度15μg/ml， 4、4℃，避光反应 10min， 5、荧光显微镜下观察，照相。 悬浮细胞： 1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为 1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有 0.02％EDTA 的0.2 5％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用 1ml 全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为 1μg/ ml，37℃孵育 7～10min。 2...