2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342 均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但是PI 不能通过正常的细胞膜,Hoechst 则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI 着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst 着色,但是正常细胞核的Hoechst 着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集。 故PI 着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst 着色的为调亡细胞。电子天平准确称取1mg 碘化丙啶(propidiu m iodide,PI)溶于10ml PBS(PH 7.2),成100u g/ml的储备液,用前等量混合(注意避光) protocol: 1、收集细胞,数量需1-2×10E6 个(悬浮细胞直接吹起即可,对于贴壁细胞用胰酶消化时,最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子,防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析),离心,11,000rpm,5min。 2、 用1ml 冰冷的PBS 重悬后,离心:11,000rpm,5min。 3、用200μl 冰冷的PBS 重悬后,用加样器混匀后,缓慢的加入含有4ml 冰冷的70%乙醇的10ml 离心管中,边加边摇匀。-20℃,过夜。(或者置 4℃,1h 后进行下一步) 4、1,500rpm,10min,小心弃上清后,用1ml 冰冷的PBS 重悬,1,500rpm,5min。小心弃上清。 5、 加入含有40μg/ml 的PI,100μg/ml 的RNase 的PBS 溶液500μl,37℃,培养 30min-1h。 混匀。 溶液配方:PBS 910μl PI 80μl RNase 10μl 共 1ml 6、过滤,供流式检测。 Hoechst 33342/PI 双染色法 紫外光激发, Hoechst-PI 双染在荧光显微镜下可见 4 种细胞形态: 活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构; 早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状; 晚期凋亡细胞(NVA) ,也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。 非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红色,核呈正常结构; 贴壁细胞: 1、培养细胞中加入hoechst染液,终浓度5μg/ml; 2、37℃,避光染色10min, 3、继续加入的PI 染液,终浓度15μg/ml, 4、4℃,避光反应 10min, 5、荧光显微镜下观察,照相。 悬浮细胞: 1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342,终浓度为 1μg/ml;帖壁生长的细胞用含有 0.02%EDTA 的0.2 5%胰蛋白酶消化成单细胞悬液,离心,弃上清,用 1ml 全培养液重悬细胞,加入Heochst 33342,终浓度为 1μg/ ml,37℃孵育 7~10min。 2...