附件 6化妆品用化学原料体外皮肤变态反应：直接多肽反应试验In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)1 范围本方法规定了化妆品用化学原料体外皮肤变态反应：直接多肽反应试验的范围、试验目的、定义、试验的基本原理、试验材料与试剂、试验步骤、数据处理、试验成立条件、结果判定标准和注意事项。本方法适用于单一组分(定量组成的物质，且其中一种主要成分含量至少 80%（W/W）)化妆品用化学原料或已知组成成分的多组分(定量组成的物质，且其中一种以上成分含量大于等于 10%，小于 80%)化妆品用原料潜在致敏性的评价。2 试验目的确定化妆品用化学原料对皮肤是否可引起变态反应。3 定义3.1 多肽消耗百分比 Percent Peptide Depletion与溶剂对比相比，受试物消耗多肽的程度。3.2 共洗脱 Co-elution受试物在 220nm 处吸收显著，并与多肽有同样的保留时间。4 试验原理有致敏性的受试物与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽模拟的皮肤蛋白共同孵育，导致多肽量减少。测定多肽量，计算多肽消耗百分比，从而判定受试物是否具有皮肤致敏性。5 试验材料与试剂5.1 多肽片段与纯度半胱氨酸多肽：Ac-RFAACAA-COOH，纯度范围：90%—95%。赖氨酸多肽：Ac-RFAAKAA-COOH，纯度范围：90%—95%。5.2 阳性对比与受试物的配制试验当天配制阳性对比和受试物溶液，浓度均为100mmol/L，阳性对比为纯度 90%以上肉桂醛。溶剂选择：乙腈、水、乙腈/水(V:V=1:1)、异丙醇、丙酮、丙酮/乙腈(V:V=1:1)，以及其他不影响肽稳定性的溶剂。若仍不溶解，依次可尝试使其溶解于 300µLDMSO 中，并用 2700µL 乙 腈 稀 释 ； 或 溶 解 于 1500µLDMSO ， 并 用1500µL 乙腈稀释。5.3 多肽贮备液的配制5.3.1 半胱氨酸多肽贮备液：称取适量半胱氨酸多肽，用 pH7.5 的磷酸盐缓冲液配制成 0.667mmol/L 的溶液。pH7.5 磷酸盐缓冲液：取 0.1mol/L 磷酸二氢钠溶液18mL 与 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 82mL 混合，测定 pH 值，应在 7.5±0.5 之间。若偏酸性，加入 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液进行调节。若偏碱性，加入 0.1mol/L 磷酸二氢钠溶液进行调节。5.3.2 赖氨酸多肽贮备液：称取适量赖氨酸多肽，用pH10.2 的醋酸铵缓冲液配制成 0.667mmol/L 的溶液。pH10.2 醋酸铵缓冲液：取醋酸铵 1.542g，加水 200mL溶解，用氨水调节 pH 值至 10.2。5.3.3 多肽标准溶液的配制稀释溶剂 A：含 20%乙腈的 ...
