第一讲基因工程考点导航1．了解基因工程的诞生。2．概述基因工程的原理及技术。3．掌握基因工程的应用。4．简述蛋白质工程。知识网络考点梳理（一）DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。2．DNA连接酶——“分子缝合针”（1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。（2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。3．运载体（运输工具）：质粒、噬菌体和动、植物病毒等（1）必备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；用心爱心专心目的基因的获取基因表达载体的构建从自然界中已有的物种中分离出来用人工的方法合成要点：同种限制酶切割目的基因与质粒将目的基因导入受体细胞受体细胞种类：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤脓杆菌、酵母菌和动植物细胞导入方法：显微注射法、农杆菌转化法、Ca＋处理细胞法等检测对象：①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质检测方法：分子检测法——①和②都是DNA分子杂交技术，③抗原－抗体杂交法形态检测法——可根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达目的基因的监测与鉴定③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；④对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动。（2）常用运载体——质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。(二)基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取：①直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中调用目的基因；②以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；③利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段；④化学合成。获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成，原因是原核生物基因中无内含子，而真核生物有内含子，在转录时要被剪切掉才能生成成熟的mRNA，动、植物中内含子的剪切方式不一样，如果用直接分离的基因将无法表达；而人工合成的基因是没有内含子的。2．基因表达载体的构建——重组质粒的构建（1）表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因①复制起始位点即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录目的基因中的标记基因最少要有2个，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达，若受体细胞表现出该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破坏了其结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明目的基因已进入受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因。（2）构建步骤：①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。②用，产生相同的黏性末端。③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。3．将目的基因导入受体细胞（1）受体种类不同，导入方法不同受体细胞种类方法植物细胞（1）农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T-DNA→农杆菌→导入植物细胞→稳定维持和表达用心爱心专心基因枪法花粉管通道法动物细胞显微注射法：目的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→新性状动物微生物细胞Ca2+处理细胞...
