现代生物科技专题(时间：40分钟满分：100分)1．(16分)(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。解析：(1)据图示信息分析：将L1GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1GFP融合基因的完整，又能保证L1GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。答案：(每空2分，共16分)(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA2．(10分)(2019·广东省实验中学高二联考)CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关注的一项新技术。该基因表达系统主要包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因Q基因进行编辑，请回答下列问题：(1)研究发现，CRISPR/Cas9仅存在于原核生物，故需借助________技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与________酶的功能相似。(2)首先依据________的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示________酶切位点。(3)质粒B大小为2.5kb(位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60b)，经酶切后的片段A大小为0.5kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为________kb。(4)常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的________上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到____________________，从而使其得以维持稳定和表达。(5)CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分析脱靶的原因________________。解析：(1)若将原核生物的基因导入真核生物中并表达，需要利用基因工程技术。根据题干信息Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，说明Cas9蛋白与限制酶的功能相似。(2)由于是对水稻产量基因Q基因进行编辑，故首先需要依据Q基因的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。根据片段A两端的限制酶种类以及片段A连接在位点Ⅰ、位点Ⅱ之间，可知位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示KpnI和BamHⅠ的酶切位点。(3)质粒B大小为2.5kb(位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60b)，经酶切后的片段A大小为0.5kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为2.5＋0.5－0.06＝2.94(kb)。(4)常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，由于农杆菌的Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故可将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到水稻细胞染色体的DNA...
