一、历史背景1、双螺旋结构和中心法则的提出为基因工程提供了理论基础。（1962年诺贝尔奖）2、限制性内切酶及其它工具酶的发现为基因的切割提供了工具。（Arber、Smith和Nathans1978年诺贝尔奖）3、PCR的发明是DNA操作技术的革命。（Mullis1993年诺贝尔奖）4、核酸和蛋白序列分析技术的成熟为分析和合成基因打开了一条新路。（Sanger因此两度获诺贝尔奖）5、复制和表达载体的发现为基因工程找到了加工场。1973年，由美同斯坦福大学教授Cohn和美国加州人学教授Boyer带领各国的研究组几乎在同时分别完成了DNA体外重组，打开了基因工程学的大门，生命科学领域兴起了一场技术革命。二、重组DNA技术是基因工程的核心技术重组DNA技术，又称为基因成分子克隆技术，包括了一系列的分子生物学操作步骤。所谓基因工程就是有意识地把某个生物体中有用的目的基因转入另—个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。一般重组DNA操作通常包括以下：1、获得需要的目的基因（外源基因）;2、在限制性内切酶和连接酶作用下与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子，这一步往往需要对重组DNA分子进行克隆和筛选；3、重组DNA分子转化受体细胞，使之进入受体细胞并能够在受体细胞中复制和遗传；4、对转化子（获得外源基因的受体细胞）进行筛选和鉴定；5、对获得外源基因的细胞或生物体通过发酵、细胞培养、养殖或栽培等，最终获得所需要的遗传性状或表达出所需要的产物。本章涉及到一些基本的生物技术，如DNA的提取、反转录合成互补的DNA片段、聚合酶链式反应（PCR）、电泳、限制性酶切、重组质粒的克隆和筛选、Southern印迹及分子杂交、DNA序列测定等等，对于这些技术的细节问题是学生很感兴趣，也是教师较为陌生的。1、获得需要的目的基因（外源基因）进行DNA重组操作，首先要获得需要的目的基因，最常用的方法包括：（1）直接从生物体中，，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，合成互补的DNA片段;（3）利用聚合酶链式反应（）特异性地扩增所需要的目的基因片段等等。1988年美国Mullis发明了聚合酶链式反应，即PCR技术，是在体外的小试管（eppondorf管）中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。该技术高效、快捷、特异性好。完成PCR需要在eppondorf管中加入4种物质：作为模板的DNA序列，即从细胞中提取分离的微量总DNA；与计划获取的目的基因双链各自5’端序列互补的两个DNA引物（20个碱基的短DNA小片段）；TaqDNA聚合酶，该酶具有很好的热稳定性；4种脱氧核苷酸，简写为dNTP（包括dATP，dTTP，dGTP和dCTP）。整个聚合酶链式反应在特制的中进行，4种反应混合物经历了变性、退火、延伸三步曲。（1）变性：在95℃高温下作为模板的双链DNA解链成为单链DNA；（2）退火：反应体系的温度降至55℃，使得部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合；（3）延伸：反应体系的温度回升到72℃左右，TaqDNA聚合酶在该合适温度条件下以目的基因为模板，逐个将4种脱氧核苷酸按人工合成的按照碱基互补的原则连接在引物之后，使合成的新链延伸，形成互补的DNA双链。如此重复进行30个循环，即可有选择地大量扩增（包括分离）一段需要的目的基因第一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍，30轮循环可获得230（1.07×109）个基因片段。此技术获得成功的关键是找到了抗高温性的DNA聚合酶。此酶是从一种嗜热水生菌（Thermusaquaticus）中分离出来的，命名为TaqDNA聚合酶。此酶最适作用温度为75-80摄氏度，但短时间在95摄氏度下仍能不失活。经过PCR获得的大量DNA片段都是以原有的微量DNA片段为模板扩增而来，将此技术亦称为分子克隆技术。在此处所谓的克隆仅是指由母模板扩增之意，与无性繁殖无关。2、构建重组质粒和基因克隆基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、连接酶、载体和宿主菌。微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后、才能实现进—步的重组、转化和表达等操作。（1）工具酶——和限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别—小段特殊的核酸序列并将其在特定位点处切开。例如，EcoRI是最早被发现的限制性内切酶，它特异性地识别...
